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纳米颗粒在病原体检测和鉴定中的应用
快速的病原体检测和鉴定在食品安全和治疗早期阶段对于避免耐药性具有相当重要的意义。现代实验室使用了许多分子生物学检测技术来区分这些耐药致病性菌株和食源性病原体,包括全基因组测序、现代PCR、多重PCR、定量PCR(qPCR)和液滴PCR。虽然实时PCR(RT-PCR)和qPCR可用于连续监测细菌的变化,但它们过于昂贵,无法在资源有限的环境中应用,而定性检测更具成本效益,在该领域占主导地位。因此,用于病原体检测和鉴定的先进而新颖的技术吸引了大量的关注。对此,纳米颗粒(NPs)因其在定性检测中更加灵敏、准确和可靠而进入人们的视野。利用纳米颗粒进行病原体检测和鉴定的研究和应用报道很多。样品制备在过去,如果我们使用金标准技术对需要在24小时内使用特定抗生素的危重病人进行测试,可能需要很长时间。然而,借助快速、高度简便的提取工艺——免疫磁分离技术,从各种临床样品中浓缩微生物的时间可以缩短到数小时内。磁性纳米颗粒(MNPs)具有优异的磁性能、低成本、分析通用性和较高的捕获效率等优点,使其在样品制备中得到广泛应用。例如,Kearns等人利用凝集素功能化的镀银MNPs和光学活性抗体包被的镀银NPs,在微离心管中分离并检测了三种细菌病原体(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA)。此外,Cowger等人开发了一种利用NPs介导质谱的新型药敏试验,耗时不到50分钟,可以区分野生型和耐药菌株(图1)。图1:利用蛋白质吸附的磁性纳米颗粒分离细菌的示意图MRI定位细菌考虑到细菌耐药性和器官损伤,应用MRI作为无创成像在感染早期定位细菌具有很大的潜力。该技术已被用于心内膜炎、骨髓炎和软组织感染模型中金黄色葡萄球菌感染的可视化。然而,这些模型检测的是炎症,而不是感染的致病因子。目前已经有一项利用铁颗粒直接可视化金黄色葡萄球菌的研究,但由于缺乏特异性,这种方法的应用受到限制。现在,开发具有特异性的分子成像探针正在进行中,包括使用铁NPs与IgG偶联来可视化细胞内病原体。有报道称,科学家通过包被结核分枝杆菌表面抗体的颗粒特异性检测肺外分枝杆菌感染。利用IPCR检测目标蛋白质在检测数目或序列无法扩增的抗原和抗体时,将一种高度敏感的技术——免疫PCR(immunopcr,IPCR)引入到这些研究中,它将免疫学和PCR结合起来检测感兴趣的蛋白质。通常,将抗体与已知的DNA序列偶联,然后用于靶向样品中的目标抗原(图2),最后使用PCR扩增该序列。伴随着IPCR的使用,典型ELISA的检出限可以提高到100~10000倍。IPCR已从其在研究中的应用扩展到诊断实验室,用于检测灵敏度更高的蛋白质。许多研究已经证明,金NPs能够增强IPCR的灵敏度。与直接与DNA结合相比,抗体更容易与金NPs结合。而且,金NPs可以与更多的DNA分子结合,从而进一步提高了IPCR的灵敏度。使用类似的策略,Chen和他的同事将IPCR与利用金NPs的生物条形码扩增相结合,检测了汉滩病毒核衣壳蛋白。图2:用于检测目标抗原的IPCR。其中DNA偶联抗体用于检测抗原,DNA序列的PCR扩增可以定量地确定抗原的存在在食品工业中的应用几十年来,食源性疾病一直是对公共卫生的严重威胁,并且仍然是一项重大的公共卫生挑战。目前已经开发出基于纳米颗粒的生物传感器来检测病原体,包括使用磁性NPs、银NPs和银纳米壳。然而,这些方法缺乏在一次检测中检测多种生物的能力。最近,三染料掺杂荧光二氧化硅NPs和量子点(QDs)被报道用于检测多种细菌。但这种策略仍然存在缺点。荧光检测方式需要使用荧光探针,容易受到光漂白和处理方式的影响,而量子点的制造困难且昂贵,表面改性复杂。参考文献1.VanGiau,V.,An,S.S.A.,&Hulme,J.(2019).Recentadvancesinthetreatmentofpathogenicinfectionsusingantibioticsandnano-drugdeliveryvehicles.Drugdesign,developmentandtherapy,13,327.https://www.tandfonline.com/doi/full/10.2147/DDDT.S1905772.Syed,M.A.,&Bokhari,S.(2011).Goldnanoparticlebasedmicrobialdetectionandidentification.Journalofbiomedicalnanotechnology,7(2),229-237.https://doi.org/10.1166/jbn.2011.12813.Wang,C.,&Irudayaraj,J.(2008).Goldnanorodprobesforthedetectionofmultiplepathogens.Small,4(12),2204-2208.https://doi.org/10.1002/smll.2008003094.Chen,L.,Wei,H.,Guo,Y.,Cui,Z.,Zhang,Z.,&Zhang,X.E.(2009).Goldnanoparticleenhancedimmuno-PCRforultrasensitivedetectionofHantaanvirusnucleocapsidprotein.Journalofimmunologicalmethods,346(1-2),64-70.https://doi.org/10.1016/j.jim.2009.05.0075.Cowger,T.A.,Yang,Y.,Rink,D.E.,Todd,T.,Chen,H.,Shen,Y.,...&Xie,J.(2017).Protein-adsorbedmagnetic-nanoparticle-mediatedassayforrapiddetectionofbacterialantibioticresistance.Bioconjugatechemistry,28(4),890-896.https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.7b000166.Kearns,H.,Goodacre,R.,Jamieson,L.E.,Graham,D.,&Faulds,K.(2017).SERSdetectionofmultipleantimicrobial-resistantpathogensusingnanosensors.Analyticalchemistry,89(23),12666-12673.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b026537.Liu,J.,Bai,R.,Li,Y.,Staedtke,V.,Zhang,S.,vanZijl,P.C.,&Liu,G.(2018).MRIdetectionofbacterialbrainabscessesandmonitoringofantibiotictreatmentusingbacCEST.Magneticresonanceinmedicine,80(2),662-671.https://doi.org/10.1002/mrm.271808.Hoerr,V.,Tuchscherr,L.,Hüve,J.,Nippe,N.,Loser,K.,Glyvuk,N.,...&Klingauf,J.(2013).Bacteriatrackingbyinvivomagneticresonanceimaging.BMCbiology,11(1),63.https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1741-7007-11-639.Moro,L.,Turemis,M.,Marini,B.,Ippodrino,R.,&Giardi,M.T.(2017).Bettertogether:Strategiesbasedonmagneticparticlesandquantumdotsforimprovedbiosensing.Biotechnologyadvances,35(1),51-63.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2016.11.007
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TEMPO催化氧化
TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基)及其衍生物是在有机氧化反应中用作催化剂的稳定硝酰自由基。TEMPO由Lebedev和Kazarnovskii于1960年首次发现。TEMPO稳定的自由基性质是由于其自身存在庞大的取代基,这阻碍了自由基与其他分子的发生反应。[1]图1.TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基)TEMPO及其衍生物主要应用于伯醇和仲醇的氧化反应。TEMPO不仅在有机溶剂中具有良好的溶解性,在水性介质中溶解性也同样优异。[1]此外,TEMPO还可以与各种用于水性介质中氧化的再氧化剂(如次氯酸盐)和用于有机介质中氧化的Cu/O2一起使用。[2] 在水性介质内,TEMPO可被同一化学计量的氧化剂(次氯酸钠)氧化并生成亚硝基鎓阳离子,作为醇氧化过程中实际的氧化剂。在醇的氧化过程中,亚硝基鎓阳离子被还原为羟胺,羟胺再通过合适的氧化剂被氧化回亚硝基鎓阳离子,以完成催化循环。次氯酸盐作为主氧化剂,溴化物作为助催化剂。[2]图2.TEMPO催化下的醇氧化机理[2]TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基)及其衍生物也可作为催化剂参与其他氧化反应。它们是高选择性氧化催化剂重金属试剂的高性价比替代品,可催化反应涉及碳-碳键、碳-氧键、碳-氧双键、碳-氮键和碳氮双键的形成。[3]应用TEMPO催化氧化反应已应用于以下领域:1,4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(4-氨基-TEMPO)催化下的氧化反应可用于制备细胞松萝酸,并可通过尺寸排阻色谱与多角度激光散射检测器联用(SEC-MALS)联用进行分析。[4]2,与TEMPO相比,2-氮杂金刚烷N-氧基(AZADO)和1-甲基-2-氮杂金刚烷-N-氧基(1-Me-AZAADO)在可将各种空间位阻醇转化为相应的羰基化合物的应用方面表现出优异的催化能力。[5]图3.2-氮杂金刚烷N-氧基(AZADO)和1-甲基-2-氮杂金刚烷-N-氧基(1-Me-AZAADO)1,TEMPO可用于催化氧化再生纤维素(粘胶人造丝)。TEMPO可将人造丝中的C6伯羟基氧化为羧基,使得产物具有水溶性。[6]2,TEMPO衍生物由于可将极性物质(如羟基或酯基)接枝到聚合物上,现已应用于聚合后改性过程。4-羟基-TEMPO(HO-TEMPO)和4-苯甲酰氧基-TEMPO(BzO-TEMPO)可作为官能化试剂应用于聚[乙烯-共-(1-辛烯)]的高效官能化。其可通过硝酰自由基与以碳-中心的自由基(如大分子自由基)的快速偶联,对极性官能团进行接枝。[7]图4. 硝酰衍生物和大分子自由基反应1,氮氧自由基衍生物与大分子自由基之间的偶联反应。[2]2,TEMPO、Ce(IV)和NaNO2三者组成的催化体系现已应用于不同醇的选择性氧化反应。在该反应中醇氧化后生成的相应醛和酮产率45.5–98.0%。[8]图5. TEMPO-Ce(IV)-NANO21,在TEMPO催化下,可将黄原胶通过区域选择性氧化合成黄原酸钠盐。通过2,2′-二苯基-1-苦基肼(DPPH)和羟基自由基的反应进程可用于评估黄嘌呤的抗氧化活性。[9]2,有报告称,通过4-乙酰氨基-TEMPO/NaClO/NaClO2催化热凝胶多糖氧化,实现了纯(1→3)-β-聚葡萄糖醛酸钠盐的制备。[10]3,通过监测TEMPO催化下原始纤维素的氧化程度,从而实现了从枣椰树制备纳米纤维素(NFC)这一反应的优化。[11]近期研究和趋势1,已开发出在储能材料领域具有重要应用前景的稳定氮氧自由基有机聚合物材料。[12] 2,Cu/TEMPO催化剂体系在二醇的好氧氧化内酯化反应中具有高效和高选择性的优势。[13]3,在漆酶(生物催化剂)和TEMPO或4-氨基-TEMPO(介质)的催化条件下,可通过纤维素纳米纤维(CNFs)的化学-酶促修饰引入表面活性醛基。[14]4,在固体-固体2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)存在下,二苯甲醇电解转化为二苯甲酮。[15]5,通过使用TEMPO替代昂贵的过渡金属催化剂作为电活性有机催化剂对醇进行环保电化学氧化。该电催化系统已被用作各种醇的快速、简单、选择性和无废物的氧化方案。[16]6,可磁分离的有机催化剂(Fe3O4@SiO2–TEMPO)在无金属和无卤素条件下。可对5-羟甲基糠醛(5-HMF)有氧氧化为2,5-二甲酰呋喃(DFF),且该反应具有高度选择性。[17]7,目前已经制备了TEMPO氧化的魔芋葡甘露聚糖(OKGM)聚合物组成的凝胶微球光响应传递系统。[18]8,(bpy)CuI/TEMPO/NMI催化剂体系(bpy=2,2′-联吡啶,TEMPO=2,2,6,6-四甲基-甲基哌啶-N-氧基,NMI=N-甲基咪唑)在苄基和脂族醇的快速和高选择性氧化中得以应用。该反应中使用的“(bpy)CuI/TEMPO”催化剂体系以MeCN溶剂和5mol%[Cu(MeCN)4](OTf)、5mol% bpy、5mol% TEMPO和10mol%NMI组成。其中苄醇的氧化速度快于脂肪醇(环己醇)。[19]上述氧化的方案如下所示(图6):图6. 氧化反应参考文献1.Fernandez MJF, Sato H. 2011. Solventeffecton(2,2,6,6-Tetramethylpiperidine-1-yl)oxyl(TEMPO):aRISM-SCF-SEDDstudy. TheorChemAcc. 130(2-3):299-304. https://doi.org/10.1007/s00214-011-0976-y2.Kiricsi I, Nagy J, Karge H, Palyi G. 1999. PorousMaterialsinEnvironmentallyFriendlyProcesses. Proceedingsofthe1stInternationalFEZAConference; 03Sep1999; Eger(Hungary)3.Zhou Z, Liu L. 2014. TEMPOanditsDerivatives:SynthesisandApplications. COC. 18(4):459-474. https://doi.org/10.2174/138527281131766601514.Shibata I, Yanagisawa M, Saito T, Isogai A. 2006. SEC-MALSanalysisofcellouronicacidpreparedfromregeneratedcellulosebyTEMPO-mediatedoxidation. Cellulose. 13(1):73-80. https://doi.org/10.1007/s10570-005-9021-45.Shibuya M, Tomizawa M, Suzuki I, Iwabuchi Y. 2006. 2-AzaadamantaneN-Oxyl(AZADO)and1-Me-AZADO: HighlyEfficientOrganocatalystsforOxidationofAlcohols. J.Am.Chem.Soc.. 128(26):8412-8413. https://doi.org/10.1021/ja06203366.Shibata I, Isogai A. 2003. 10(4):335-341. https://doi.org/10.1023/a:10273304094707.Passaglia E, Coiai S, Cicogna F, Ciardelli F. 2014. Somerecentadvancesinpolyolefinfunctionalization. Polym.Int.. 63(1):12-21. https://doi.org/10.1002/pi.45988.Yan Y, Tong X, Wang K, Bai X. 2014. HighlyefficientandselectiveaerobicoxidationofalcoholsinaqueousmediabyTEMPO-containingcatalyticsystems. Catalysis Communications. 43112-115. https://doi.org/10.1016/j.catcom.2013.09.0229.Delattre C, Pierre G, Gardarin C, Traikia M, Elboutachfaiti R, Isogai A, Michaud P. 2015. AntioxidantactivitiesofapolyglucuronicacidsodiumsaltobtainedfromTEMPO-mediatedoxidationofxanthan. CarbohydratePolymers. 11634-41. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2014.04.05410.Watanabe E, Tamura N, Saito T, Habu N, Isogai A. 2014. PreparationofcompletelyC6-carboxylatedcurdlanbycatalyticoxidationwith4-acetamido-TEMPO. CarbohydratePolymers. 10074-79. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2012.11.09411.Benhamou K, Dufresne A, Magnin A, Mortha G, Kaddami H. 2014. ControlofsizeandviscoelasticpropertiesofnanofibrillatedcellulosefrompalmtreebyvaryingtheTEMPO-mediatedoxidationtime. CarbohydratePolymers. 9974-83. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.08.03212.Hughes BK, Braunecker WA, Ferguson AJ, Kemper TW, Larsen RE, Gennett T. 2014. QuenchingofthePeryleneFluorophorebyStableNitroxideRadical-ContainingMacromolecules. J.Phys.Chem.B. 118(43):12541-12548. https://doi.org/10.1021/jp506240j13.Xie X, Stahl SS. 2015. EfficientandSelectiveCu/Nitroxyl-CatalyzedMethodsforAerobicOxidativeLactonizationofDiols. J.Am.Chem.Soc.. 137(11):3767-3770. https://doi.org/10.1021/jacs.5b0103614.Jauovec D, Vogrini R, Kokol V. 2015. Introductionofaldehydevs.carboxylicgroupstocellulosenanofibersusinglaccase/TEMPOmediatedoxidation. Carbohydrate Polymers. 11674-85. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2014.03.01415.Kaluza D, Jönsson-Niedziólka M, Ahn SD, Owen RE, Jones MD, Marken F. 2015. Solid-solidECTEMPO-electrocatalyticconversionofdiphenylcarbinoltobenzophenone. JSolidStateElectrochem. 19(5):1277-1283. https://doi.org/10.1007/s10008-014-2722-616.Karimi B, Rafiee M, Alizadeh S, Vali H. Eco-friendlyelectrocatalyticoxidationofalcoholsonanovelelectrogeneratedTEMPO-functionalizedMCM-41modifiedelectrode. GreenChem.. 17(2):991-1000. https://doi.org/10.1039/c4gc01303d17.Karimi B, Mirzaei HM, Farhangi E. 2014. Fe3O4@SiO2-TEMPOasaMagneticallyRecyclableCatalystforHighlySelectiveAerobicOxidationof5-Hydroxymethylfurfuralinto2,5-DiformylfuranunderMetal-andHalogen-FreeConditions. ChemCatChem. 6(3):758-762. https://doi.org/10.1002/cctc.20130108118.Chen X, Wang S, Lu M, Chen Y, Zhao L, Li W, Yuan Q, Norde W, Li Y. 2014. FormationandCharacterizationofLight-ResponsiveTEMPO-OxidizedKonjacGlucomannanMicrospheres. Biomacromolecules. 15(6):2166-2171. https://doi.org/10.1021/bm500327m19.Hoover JM, Ryland BL, Stahl SS. 2013. MechanismofCopper(I)/TEMPO-CatalyzedAerobicAlcoholOxidation. J.Am.Chem.Soc.. 135(6):2357-2367. https://doi.org/10.1021/ja3117203
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CXCR4:细胞外泛素的受体
泛素是一种存在于所有真核生物中的小蛋白。泛素与细胞内蛋白质的共价连接称为泛素化。泛素化是一个多步骤的酶促过程,需要E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶,相反,泛素的去除则由一系列去泛素化酶完成。调节这些酶的活性可以调节泛素相关途径和活性[1-4]。泛素化通常标记蛋白质进行蛋白酶降解,此外,泛素化也可以参与调节过程,例如蛋白质定位、酶活性和蛋白质-蛋白质相互作用[3-4]。蛋白质是单泛素化还是多泛素化,以及形成多泛素链的泛素连接类型,都会对蛋白质功能产生不同的影响[4-5]。越来越多的证据表明泛素可能具有细胞外功能,细胞外泛素可以调节细胞生长和凋亡,诱导抗菌活性并调节免疫反应[6-15]。此外,泛素可以抑制促炎细胞因子TNF-α的产生,促进IL-4、IL-10和IL-13的产生[10-15]。然而,这些影响的机制尚不明确。Saini及其同事的研究提供的证据表明泛素具有激活膜受体的能力。荧光标记的泛素表现出典型的受体结合特征。此外,外源性泛素可以刺激受体,激活细胞反应特征,包括Ca2+通量、细胞内cAMP减少、RSK1,Akt和ERK1/2的下游磷酸化。通过结合生物测定、药理学、siRNA敲除和受体竞争实验,推断泛素受体为CXCR4[16-18]。CXCR4是一种G蛋白偶联受体,因介导趋化因子CXCL12/SDF-1的活性而闻名。CXCL12/SDF-1是一种有效的白细胞趋化剂。CXCR4还可以与巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)结合,充当HIV-1的CD4共受体,并通过其对细胞运动、细胞存活和血管生成产生影响,促进癌症研究进展。在许多方面,CXCL12和泛素的体外生物活性相似。两者都刺激Gαi/o的激活,促进Ca2+运动,并诱导相似的激酶磷酸化。这两种蛋白质也被证明可以在体外诱导趋化性,尽管泛素的效力稍弱一些。此外,CXCR4抑制剂还可阻断泛素和CXCL12诱导的激酶信号传导以及对细胞运动产生影响。虽然两者有很多相似的地方,但也存在一些不同之处。以CXCL12和泛素通过与CXCR4的相互作用发挥其活性为例。CXCL12诱导的信号传导需要与CXCR4的N末端区域进行初始相互作用,然后与细胞外环结合。不同的是,泛素与相同的细胞外环结合,不需要与N末端结合。此外,与CXCL12不同,泛素不会干扰HIV-1与CXCR4的结合,并且不具有抑制感染性的能力[18-21]。人们对泛素活动的兴趣越来越大。尽管最初被定义为细胞外因子,但大多数研究都集中在其细胞内作用。将CXCR4确定为泛素的受体,会提供一种新研究途径,如建立细胞外泛素对免疫系统功能影响的潜在机制等[9-15]。参考文献1. Ozkaynak,E.etal.(1984)Nature312:663.2. Goldstein,G.etal.(1975)Proc.Nat.Acad.Sci.USA72:11.3. Ben-Neriah,Y.(2002)Nat.Immunol.3:20.4. Schnell,J.D.&L.Hicke(2003)J.Biol.Chem.278:35857.5. Behrends,C.&J.W.Harper(2011)Nat.Struct.Mol.Biol.18:520.6. Daino,H.etal.(2000)Blood95:2577.7. Singh,M.etal.(2010)Cardiovasc.Res.86:20.CitestheuseofR&DSystemsProducts8. Kieffer,A.E.etal.(2003)FASEBJ.17:776.9. Nakamura,M.etal.(1996)J.Immunol.156:533.10. Majetschak,M.etal.(2003)Blood101:1882.CitestheuseofR&DSystemsProducts11. Majetschak,M.etal.(2004)Surgery135:536.CitestheuseofR&DSystemsProducts12. Majetschak,M.etal.(2004)J.Trauma56:991.CitestheuseofR&DSystemsProducts13. Patel,M.B.etal.(2006)J.Surg.Res.135:226.14. Garcia-Covarrubias,L.etal.(2008)Crit.CareMed.36:979.15. Majetschak,M.(2011)J.Leukoc.Biol.89:205.16. Saini,V.etal.(2010)J.Biol.Chem.285:15566.CitestheuseofR&DSystemsProducts17. Saini,V.etal.(2010)Commun.Integr.Biol.3:608.18. Saini,V.etal.(2010)J.Biol.Chem.286:33466.CitestheuseofR&DSystemsProducts19. Busillo,J.M.&J.L.Benovic(2007)Biochim.Biophys.Acta.1768:952.20. Teicher,B.A.&S.P.Fricker(2010)Clin.CancerRes.16:2927.21. Bernhagen,J.etal.(2007)Nat.Med.13:587.CitestheuseofR&DSystemsProducts